一、补益脾胃法延缓脑老化的实验研究
人口老龄化在当前已成为世界性问题。据我国第四次人口统计预测,到本世纪末全国老年人口将达到13亿,届时,我国将进入老龄结构社会,每10人中就有1名老人。为此,探索衰老机理、研究延缓衰老药物以及常见老年病的治疗,已成为重要的科研课题。
中医学在衰老和抗衰老方面有独特的理论和丰富的临床实践经验。中医的衰老理论主要有“脏腑虚衰说”、“阴阳失调说”、“气血失衡说”,抗衰老的原则为“协调阴阳”、“补肾益精”、“补益脾胃”等。在对衰老理论的研究中,我们发现,脑是衰老过程中最突出的器官,是人和动物老年性功能障碍的主要病灶之一。机体随年龄的增长,脑组织的形态、代谢和功能等方面都出现一系列退行性变化;脑功能降低是老化的重要表现,脑可能是导致衰老的“起动器”。因此,抗衰老应将延缓脑老化作为重要课题进行研究。
延缓脑老化多从脾肾两脏着手。脑老化固然与肾中精气虚衰有密切关系,但脾胃虚衰亦占有相当重要的位置。《素问·营卫生会篇》中记载“老人昼不精,夜不暝”是由于“营气衰少,卫气内伐”,而营卫之气为脾胃运化的水谷精气所化生。宋代养生家陈直说:“脾胃者,五脏之宗也,四脏之气,皆禀于脾,故四时皆以胃气为本”(《寿亲养老书》)。现代著名老中医岳美中教授谓:“人之始生,先成于精,肾精旺而后有脾胃,即所谓先天生后天;人之衰老,肾精先枯,累及诸脏,此时全仗脾胃运化,吸收精微,使五脏滋荣,元气得健,才能却病延年,即所谓后天养先天。”这些论述为补益脾胃法延缓脑衰老的确立,奠定了理论基础。
实验研究根据现代医学衰老的自由基学说,从膜分子生物学水平,探讨了补益脾胃法延缓脑老化的作用及其机制。
实验用健康昆明种小白鼠,16月龄,雌雄各半,共50只。分为对照组、维生素E组、温运脾阳组、滋补脾阴组、健脾益气组,每组各10只。
温运脾阳方由干姜、党参、白术等组成;滋补脾阴方由人参、白芍、山药等组成;健脾益气方由黄芪、白术、大枣等组成。以上药物服药剂量均为成人剂量的18倍。
实验从小鼠16月龄开始,给药途径为灌胃,每只小鼠灌胃量为015ml/10g体重。空白对照组每天投与09%盐水,阴性对照组(维生素E组)同时投与制备好的维生素E乳剂,实验组每天分别投与温运脾阳方、滋补脾阴方、健脾益气方水煎剂。各组每周灌胃6天,停1天,连续3个月后处死取材。
观察指标有脑组织脂质过氧化物及其相关抗氧化酶、细胞膜脂质构成等。结果表明:
1.对老龄小鼠脑组织脂质过氧化物的影响:
①补益脾胃方药、维生素E均能不同程度地降低共轭双烯(CD),而补益脾胃方药的作用优于维生素E,三组补益脾胃方药作用效果的差别不显著。
②补益脾胃方药、维生素E均能显著降低丙二醛(MDA),但补益脾胃方药、维生素E之间作用效果的差别不显著。
③补益脾胃方药、维生素E均能显著降低脂褐素(LSFP),三组补益脾胃方药、维生素E之间作用效果差别不显著。
2.对脑组织抗氧化酶活性的影响:
①对硒谷胱甘肽过氧化物酶(Se-GSH-Px)活性结果分析:补益脾胃方药的作用优于维生素E,三组补益脾胃方药之间作用无显著差异。
②补益脾胃方药均能显著提高老龄小鼠脑组织铜锌超氧物歧化酶(Cu Zn-SOD)的活性,且温运脾阳方药、健脾益气方药作用优于维生素E,维生素E对提高Cu Zn-SOD活性作用不显著,滋补脾阴方药与维生素E之间作用无显著差异。
③补益脾胃方药、维生素E对提高老龄小鼠脑组织过氧化氢酶(CAT)活性作用不显著。
3.对脑细胞膜脂质构成的影响:
①补益脾胃方药及维生素E均能显著降低大脑细胞磷脂中神经磷脂(SM)含量,其组间作用无显著差异。
②补益脾胃方药及维生素E均不能增高小鼠大脑细胞膜磷脂中磷脂酰胆碱(PC)及磷脂酰乙醇胺(PE)的含量。
③补益脾胃方药及维生素E均能显著降低细胞膜老化指数(SM/PC)值,且组间作用无显著差异。
④补益脾胃方药及维生素E均不能增高小鼠大脑细胞膜中磷脂(PL)的含量。
⑤温运脾阳方药、滋补脾阴方药均能显著降低脑细胞膜中胆固醇(CH)的含量,但组间无显著差异。而健脾益气方药、维生素E对降低细胞膜中胆固醇含量作用不显著。
⑥温运脾阳方药、滋补脾阴方药均能显著降低细胞膜老化指数(CH/PL)值,但组间作用无显著差异,而健脾益气方药及维生素E作用不显著。
本研究从中医学整体观念出发,以“脏腑虚衰说”为理论依据,采用“温运脾阳”、“滋补脾阴”、“健脾益气”法,旨在从膜分子生物学水平,探讨补益脾胃方药延缓脑老化的作用机制。结果表明,补益脾胃法是防止脑老化,延缓衰老的重要原则。其作用机制可能是:第一,调节脑组织的过氧化损伤与抗氧化系统之间的平衡协调,提高其抗氧化能力,作为抗氧化剂控制大脑的衰老,从而达到推迟机体衰老的进程。第二,通过对脑细胞膜脂质组成改变的影响而调节脑细胞的膜结构及功能,以满足细胞膜修复的需要,作为膜修饰剂达到延缓细胞衰老的目的。
二、滋补脾胃法治疗老年性痴呆作用机理的实验研究
中医学认为痴呆多因先天禀赋不足,或老年精气亏虚或情志失调、外伤、中毒等致脑的智能活动障碍,以呆傻愚笨为主要临床表现的一种神志疾病。其轻者可见神志淡漠、寡言少语、迟钝、笨拙、愚昧、愣傻、健忘等证。重则表现为终日不语,或闭门独居,或口中喃喃自语,或言辞颠倒,举动不经,或忽笑忽哭,可不欲食,数日不知饥饿等。本病早在先秦时期即有记载,《左传》中谓之“白痴”,后世医家根据其症状特点称之为“呆病”。所谓“呆”,癫也,痴也,不慧也,不明事理之谓也。《灵枢·海论》云:“髓海不足,脑转耳鸣,胫酸眩冒,目无所见,懈怠安卧。”《华佗神医秘传·治痴呆神方》云:“此病患者,常抑郁不舒,有由愤怒而成者,有由羞恚而成者。”汉·华佗始称本病为“痴呆”,其后有“呆痴”、“文痴”、“武痴”等称谓。明·李时珍指出“脑为元神之府”,为本病的病位奠定了基础。
学习及记忆是大脑的最高级机能之一,是智能的重要组成部分。老年性痴呆(AD)为大脑皮质的退行性改变,主要表现为学习记忆障碍,其病因病理学研究结果与脾虚证有密切关系。
脾虚失运为本病发生的重要原因,因此滋补脾胃法是治疗本病的重要手段。
1.实验方法
实验研究选用22月龄纯系SD大白鼠70只(由中国医科大学实验动物中心提供),雌雄各半,随机分成七组,健康对照组—A组、空白对照组—B组(包括空白疾病组B1和空白病证结合组B2)、西药对照组—C组(包括西药疾病组C1和西药病证结合组C2)、中药实验组—D组(包括中药疾病组D1和中药病证结合组D2),每组各10只。首先用复合因素建立脾虚证候模型,在此基础上用氯化铝(Al Cl3)建立痴呆疾病(AD)模型,最终塑造出脾虚痴呆的病证结合模型。
关于动物痴呆的诊断标准,目前公认的方法是智能测定,有避暗、穿梭、迷宫、跳台等方法。
本实验采用避暗和穿梭实验测定大白鼠学习记忆能力的变化。普遍认为长期胃饲Al Cl3造成的痴呆模型为AD病模型。
从实验的第16天至第106天,西药组投以9mg/ml的乙酰胺吡咯烷酮(脑复康)蒸馏水溶液2ml/日/只胃饲。中药组予滋补脾胃方药(人参、白芍、山药等),制成100%浓度药液,2ml/日/只胃饲。健康及空白对照组同时予同剂量的生理盐水。
2.观察指标
①学习记忆能力;
②脑组织磷脂的构成;
③脑组织脂质过氧物及抗氧化酶活性;
④血中乙酰胆碱酯酶(Ach E)的活性和大脑细胞膜胆碱能M-受体的结合容量;
⑤海马的超微结构。
3.实验结果
(1)对智能的影响:
①避暗实验结果,各痴呆病组智能均出现障碍,中西药能明显改善其学习记忆能力。
②穿梭实验结果,空白对照组,包括疾病组和病证结合组有明显的学习记忆障碍,而中药组的痴呆症状基本恢复正常,且中药组优于西药组。
(2)对脑组织磷脂的影响:
①痴呆大白鼠大脑组织磷脂(SM)中神经磷脂的含量显著增多,中西药均能显著降低神经磷脂的含量,甚至比健康对照组更低。
②脾虚痴呆大白鼠大脑组织磷脂中磷脂酰胆碱(PC)含量显著降低,中西药均能显著使其含量回升,恢复至正常。
③脾虚痴呆大白鼠大脑组织磷脂中磷脂酰丝氨酸(PS)含量降低,中西药均不能恢复其含量。
④磷脂酰肌醇和磷脂乙醇胺各组间均无显著性差异(P>005),说明痴呆及脾虚证大白鼠大脑组织磷脂中磷脂酰肌醇(PI)和磷脂酰乙醇胺(PE)的含量均无变化,且中西药对其含量均无影响。
⑤脾虚证使大白鼠脑组织老化指数(SM/PC)明显升高,中西药能使其老化指数恢复正常。
(3)对脑组织脂质过氧化物的影响:
①共轭双烯(CD)结果分析:脾虚证和痴呆病均能使脂质过氧化一级反应产物增多,且脾虚痴呆比单纯痴呆更增多。中西药均能明显降低脂质过氧化的一级反应产物,中药的作用效果明显优于西药(包括脾虚痴呆和单纯痴呆)。西药虽然对痴呆病脂质过氧化一级产物有降低作用,但不能消除脾虚证所产生的影响,而中药对痴呆病和脾虚证所造成的脂质过氧化一级产物的增多都有降低作用。
②丙二醛(MDA)结果分析:脾虚证和痴呆病均使脂质过氧化二级反应产物增多,中西药均能显著降低脂质过氧化的二级反应产物,中药的作用效果明显优于西药(包括脾虚痴呆和单纯痴呆)。虽然脾虚痴呆组与单纯痴呆组无显著性差异,但从数据看,脾虚痴呆组值高于单纯痴呆组。
(4)对脑组织抗氧化酶活性的影响:
①脾虚证和痴呆病均使谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性降低,单纯痴呆比脾虚痴呆更重。中西药均能显著提高谷胱甘肽过氧化物酶的活性,且中西药均能消除脾虚证所造成的影响,中药的作用效果明显优于西药(包括脾虚痴呆和单纯痴呆)。
②脾虚痴呆动物过氧化氢酶(CAT)活性降低,而单纯痴呆则无变化。中药极显著地提高过氧化氢酶的活性,甚至超过了健康对照组,西药无明显效果。
(5)对血中胆碱酯酶(Ach E)活性的影响:脾虚痴呆动物胆碱酯酶活性增高,单纯痴呆动物其活性虽未见明显变化,但脾虚痴呆与单纯痴呆无明显差异。中西药均能降低其活性,使其恢复正常水平,中西药无明显差别。
(6)对大脑细胞膜胆碱能M-受体功能的影响:痴呆病M-受体结合容量下降,中西药均使其恢复正常,且中西药无明显差异。
(7)对海马超微结构的影响:
①空白对照组:细胞核色淡,在胞质中出现电子密度低,内无结构的大面积变性坏死区,许多电子密度高且不均匀的脂褐素、空泡样变、胞质结构减少,有髓神经纤维内结构减少,将近坏死。
②西药对照组:细胞核膜轻度肿胀,有髓神经纤维轻度肿胀,偶见断裂、打结现象,胞质中有少量脂褐素颗粒及空泡、多核糖体增多。
③中药实验组:细胞核规则,核膜清晰,胞质中偶见空泡、多聚核糖体增多,有髓神经纤维结构正常,轴突内有丰富的微丝。
4.机理探讨
滋补脾胃方药能有效地预防和治疗老年性痴呆病,提高大白鼠长期及短期的学习记忆能力,其疗效优于目前公认治疗AD病的西药脑复康。其作用机理如下:
(1)通过改善脑组织的磷脂构成,降低PS含量,增加PC含量,降低老化指数(SM/PC),从而保证了脑细胞膜的正常结构和功能。
(2)通过调节体内脂质过氧化反应,降低脂质过氧化的一级反应产物CD及二级反应产物MDA,提高机体抗氧化酶GSH-Px及CAT的活性,从而降低了脑细胞的过氧化损伤。
(3)通过降低Ach E的活性,提高M-受体的结合容量,从而使胆碱能神经系统发挥其正常的功能。
(4)通过修复海马神经细胞的损伤,减少变性坏死、空泡变性及脂褐素形成等病理改变,改善了脑细胞的结构。
本实验证明,脾虚证与AD病有密切关系,脾虚失运、气血化源不足是AD病发病的重要原因,滋补脾胃方药能有效地延缓衰老进程,提高大白鼠的学习记忆能力,协调各系统的平衡,是治疗AD病的重要手段。再次印证了“脾主思”的理论,脾虚证与痴呆病的关系及脾胃学说在脏象学说中的重要地位,充实了脾虚证实质的研究,为滋补脾胃法治疗AD病及延缓衰老提供可靠的依据。